保护膜损性乙对大甾醇作用胃黏研究一沙棘鼠急伤的醇型

随着社会经济的沙棘鼠急伤快速发展，人们的甾醇作用生活水平不断提高，生活方式发生了较为深刻的性乙变化。人们饮酒量的醇型需求也在日益增加。与此同时，胃黏酒精引起的膜损消化系统问题越来越受到关注。因此，保护寻找具有保护胃黏膜功能的研究生物活性物质已成为人类关注的热点之一。沙棘甾醇是沙棘鼠急伤沙棘油中的天然活性成分之一，是甾醇作用植物生长过程中重要的次生代谢产物，具有多种药理活性功能。性乙本实验以沙棘籽油为样品，醇型采用皂化法提取样品中的胃黏甾醇并对工艺进行优化，经无水乙醇反复重结晶得到纯化沙棘甾醇，膜损采用磷硫铁显色法测定甾醇含量(总甾醇含量为84.5％)，保护参考文献并稍作修改。研究了沙棘甾醇对大鼠急性乙醇型胃黏膜损伤的生化指标和病理学影响，初步阐述了沙棘甾醇对乙醇型胃黏膜损伤的保护作用。

一、材料

1、动物

SPF级SD大鼠112只，雌雄各半，体重160±15g，购自西安交通大学医学院实验动物中心，实验动物许可证号SCXK(陕)2017-003。大鼠自由进食水，明暗周期12h，室温22-25℃，相对湿度40％～60％。适应周期为7d。

2、药品

采用皂化法提取沙棘籽油甾醇并对工艺进行优化，得出最佳皂化工艺条件，经气相色谱-质谱联用(GC-MS)检测鉴定，沙棘籽油甾醇种类有菜油甾醇、△7-燕麦甾烯醇、β-谷甾醇、△5-燕麦甾烯醇4种；40℃烘干备用。

实验鼠维持饲料：江苏省协同医药生物工程有限责任公司；盐酸雷尼替丁胶囊(湖北民康制药有限公司，规格：0.15g／粒，国药准字：H42021353)；乌拉坦(Adamas试剂有限公司，生产货号：51-79-6)。

3、试剂

SOD、MDA、GSH-Px试剂盒(南京建成生物工程研究所)；TNF-a、MTL、PEG2、HEX-β、cAMP试剂盒(武汉优尔生科技股份有限公司)；橄榄油(天津嘉里粮油有限公司，生产日期：B20171123X)、0.9％生理盐水(山东齐都药业有限公司)、75％乙醇(天津市富宇精细化工有限公司)。

4、仪器

酶标仪(美国ThermoFisher公司)、台式高速离心机(德国艾本德公司)、数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)、电子分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)、加热磁力搅拌器(德国IKA公司)。

二、方法

1、供试物制备

沙棘甾醇和盐酸雷尼替丁胶囊在灌胃给药前，研磨成粉后溶解(悬浮)于橄榄油中，通过加热磁力搅拌器和超声处理获取均质的溶液。

2、实验分组、造模和给药

实验前对各组大鼠进行称量、标号并记录。将大鼠按体重随机分为正常对照组、模型对照组、橄榄油对照组、盐酸雷尼替丁组、沙棘甾醇低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组16只，雌雄各半。对照组及模型组灌胃生理盐水，橄榄油组灌胃橄榄油，其余各组按盐酸雷尼替丁组(50mg·kg^-1·d^-1)、沙棘甾醇低剂量组(100mg·kg^-1·d^-1)、沙棘甾醇中剂量组(200mg·kg^-1·d^-1)和沙棘甾醇高剂量组(400mg·kg^-1·d^-1)给药。灌胃容积为10mL／kg，每日灌胃1次，连续给药7d。实验前一天禁食不禁水24h。末次空腹给药2h后，除正常对照组外，其余各组灌胃75％乙醇制备急性胃黏膜损伤模型，各治疗组用药剂量根据成人量换算动物剂量倍数简表计算得出。

三、检测指标

1、胃组织形态及病理学检查

造模2h后，每组随机选取2只大鼠，20％乌拉坦腹腔注射麻醉。打开大鼠腹腔，结扎幽门与贲门，取出全胃，用PBS缓冲液冲洗胃内杂质，剪取大鼠胃组织(0.5cm×O.5cm)置于2.5％戊二醛溶液中做电镜检查。经固定、组织脱水、浸透包埋，制备半薄切片，在透射电镜下，甲苯胺蓝染色、定位，在10000倍下观察，随机CCD相机采集照片。

2、样品采集

每组剩余14只大鼠均打开腹腔，取出全胃，结扎幽门与贲门，组织置于-80℃储存，用于相关指标的测定。横切一块胃组织，在冷生理盐水中漂洗，去除血液，滤纸吸干，称重；在加入9倍体积的PBS磷酸缓冲盐溶液，组织匀浆机10000-15000ffmin上下进行研磨，待溶液中无纤维状物质即为匀浆完全，3000r／min离心10min，取上清，即为10％胃组织匀浆液。

3、胃组织抗氧化指标测定

利用BCA法测定大鼠胃组织中蛋白的含量。黄嘌呤氧化酶法测定大鼠胃组织中SOD酶活力，采用SOD测定试剂盒(微量法)。取大鼠胃组织匀浆18μL，依次按步骤加入试剂盒中的试剂，充分混匀，室温静置30min，于560nm处测OD值，计算各组大鼠胃组织中SOD酶活性。

硫代巴比妥酸法测定大鼠胃组织中MDA含量，采用MDA试剂盒。取待测胃组织匀浆200μL于96孔板中，依次加入试剂盒中的试剂，旋涡混匀器混匀，95℃水浴中保温30min，置于冰浴中冷却，1000×g，25℃，离心10min；测定532nm和600nm处的吸光度，记为A532和A600，△A=A532-A600，计算各组大鼠胃组织中MDA含量。

DTNB法测定大鼠胃组织中GSH—Px酶活性，采用GSH-Px试剂盒。取待测胃组匀浆0.2mL，依次加入试剂盒中的试剂，混匀，1700×g，离心10min，取上清液lmL做显色反应，显色反应结束后，室温静置15min，412nm处测得OD值，计算各组大鼠胃组织中GSH-Px酶活力。

4、胃组织中TNF-a、PGE2、HEX-β、cAMP含量的测定

采用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测大鼠胃组织匀浆中TNF-a、PGE2、cAMP、HEX-β的含量；取待测匀浆，按试剂盒加样于96孔板，37℃孵育1小时，吸弃，加检测溶液A，37℃孵育lh，洗板3次，加检测溶液B，37℃孵育30min，洗板5次，加TMB底物，37℃孵育15min，加终止液，读取OD值。

5、数据统计分析

采用SPSS17.0软件进行统计学处理及分析，以均数±标准差(±S)表示，组间比较采用单因素方差分析(one-wayANOVA)，P＜0.05为有显著差异。

四、结果与分析

1、沙棘甾醇对急性损伤大鼠胃组织形态的影响

取胃组织进行大体形态观察，结果显示，对照组大鼠胃组织结构完整，大小、形态正常，胃黏膜清洁。模型对照组表现出明显的黏膜损伤，出现黑褐色的出血点。沙棘甾醇中、高剂量组和雷尼替丁组的胃黏膜损伤程度与模型组比较均有不同程度的减轻，其中以高剂量效果最好。结果见图1。

2、沙棘甾醇对急性损伤大鼠胃组织病理学的影响

如图2所示，正常对照组大鼠胃黏膜细胞结构清晰，细胞核圆形，核内染色质分布基本均匀；细胞质内线粒体丰富、嵴短小，细胞内可见较多堆叠排列的粗面内质网。模型对照组，胃黏膜壁细胞及主细胞明显肿胀，壁细胞数量增多、体积较大、核内常染色质稀疏、线粒体肿胀，部分线粒体嵴溶解、消失，粗面内质网减少。阳性药物盐酸雷尼替丁组胃黏膜壁细胞及主细胞结果清晰，壁细胞轻度肿胀，细胞核圆形，核内染色质轻度凝集；细胞质内线粒体丰富，轻度肿胀。

沙棘甾醇各剂量组随着剂量的增加，胃黏膜壁细胞及主细胞结构逐渐趋于正常，细胞肿胀度减轻，细胞核形状渐转规则，核内染色质均匀，线粒体肿胀逐步减轻，粗面内质网丰富。
 

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